晶研谈 | 必读精品：晶型筛选指南

以下文章来源于何运良博士的公众号药物晶体和结晶，转载已获授权

本指南介绍了晶型筛选的基本方法和流程，包括实验方法、样品分析、晶型分类、稳定性分析和判断等。本指南主要内容是四年前在前公司完成的，最初是为了指导新员工做晶型筛选。公司里人员流动性太大，每来一批新员工都要重新培训，实在太累了，所以写个指南让他们自学，掌握基本流程。该指南是在十几个筛选项目和十多年结晶工艺开发的经验上总结而成，并参考了几本晶型研究相关英文专著。新员工按照此指南可以顺利完成 80% 以上的晶型筛选项目。

研究流程

晶型筛选流程和常用分析方法见图[1]。

刚拿到的原料需要先做一次全面的表征（注意括号里的可以不做），因为纯度对晶型影响很大，有些杂质会阻碍特定晶型的形成。杂质含量高时倾向于油析或者形成无定型。

图1 晶型筛选流程图

测溶解度是为了设计筛选方法，如果溶解度很小的溶剂，只能做反溶剂，用于溶析结晶或者混悬转晶，可以不做蒸发结晶和冷却结晶。有足够溶解度的溶剂，溶析、蒸发和冷却结晶和悬浮转晶都是要考虑的。

做完筛选实验后，会得到大量样品，先用显微镜看看，是不是晶体。如果是，测 XRD 。最后所有的晶体样品根据XRD图进行分类。每一类挑一个样品做 DSC 和 TGA ，看看是无水晶型、水合物还是溶剂化合物。无水晶型和水合物是我们关注的重点，溶剂化合物一般不用。水合物和溶剂化合物脱溶剂后往往也会得到无水晶型，这是必须要考察的，通过 DSC 加热就可以得到，或者热载台也可以。

得到各种晶型后，要研究晶型之间的稳定性和相对转化关系，主要是无水晶型和水合物。根据热力学定律，常温下稳定晶型只会有一个，其它的无水晶型都是亚稳晶型。各种无水晶型混合后混悬转晶，会转变成一种晶型，往往是稳定晶型。注意溶剂的影响比较大，有时不同溶剂得到的晶型可能不一样，有些溶剂得到的不是稳定晶型，所以要考察不止一种溶剂。如果没有转化，可能是因为溶解度太小，需要换溶解度更大的溶剂。DSC 也能给我们一些线索，熔点最高的晶型，如果熔化焓值也最高，那么它是稳定晶型，其它的都是亚稳定的。如果熔点最高，熔化焓却不是最高，则可能存在互变晶型，即低温下的稳定晶型和高温下的稳定晶型不是一种晶型，两种晶型存在某个温度转折点。

如果水合物足够稳定而且容易得到，我们也会选择水合物做最后的晶型开发。对于水合物，溶剂里水含量（活度）达到某个临界值水合物才会稳定。我们需要通过在不同水含量的溶剂中做水合物和稳定无水晶型的混悬竞争实验，来确定临界水含量。这个水含量对确定结晶溶剂的质量标准非常关键。有时水合物非常容易形成，溶剂不加水，也能从空气中吸收水分形成水合物。这种现象在蒸发结晶时比较常见，但是在溶析或者冷却时，如果没有加水而出现水合物，这一定要小心了，可能是误判。

溶剂选择

建议筛选用溶剂包括常见的 ICH 2类溶剂和 3类溶剂，溶剂沸点最好不要超过 100℃。按分类应该包括：醇类、醚类、酯类、酮类、烷烃、水等。这些溶剂应该至少选择一种有代表性的。常用的溶剂有：甲醇、乙醇、异丙醇、水、丙酮、丁酮、乙酸乙酯、THF、2-Me-THF、异丙醚、甲基叔丁基醚、正庚烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲苯、DMSO、DMF。

 实验方法

● 1．溶解度测量

建议用混匀仪去测量溶解度，磁力搅拌效果不好，而且温度控制不准。溶解度一般测两个点，室温的和高温的（50~70℃）。固液平衡有时需要很长时间，尤其是有大颗粒的时候，建议测溶解度时至少振荡过夜。不断加入溶剂，至大部分溶清，再过夜。少量颗粒可以忽略。对于不稳定的物质，溶解度测量不宜时间太长。

● 2．筛选实验 

晶型筛选本质上还是一个结晶研究过程，结晶的理论知识非常有帮助。常见的结晶方法有蒸发结晶、冷却结晶、溶析结晶、反应结晶、悬浮转晶（打浆），热转变、脱溶剂或者脱水和机械研磨。目前96孔板用到的筛选方法主要是蒸发和溶析结晶。

总的说来，晶型的最大影响因素是结晶溶剂，这是目前绝大部分筛选方法的理论依据。其次还有温度、结晶方法、结晶速率和过饱和度等。筛选实验应该根据溶解度来设计，不要每个化合物用同样的方法。根据溶解度可以分成良溶剂和不良溶剂，这是溶剂选择的主要依据。

图2 某药企固研实验室

单一溶剂蒸发结晶应该是首先要考察的，因为蒸发总会出来固体。混合溶剂蒸发，蒸发到最后可能只剩下一种溶剂了，意义有限，其次溶剂比例也有影响，蒸发没法控制比例。不良溶剂可能没法溶解足够固体做蒸发结晶，可以加入少量低沸点的良溶剂来做蒸发结晶。这样良溶剂蒸发后接近单一溶剂了。

混合溶剂筛选可以首先考虑溶析结晶和蒸发结晶，都可以在 96 孔板上完成。溶析析晶析出固体后，就可以测样了，不要等到溶剂挥发干。这点在 96 孔板筛选时要注意，等溶剂挥发的差不多了，可能就变成单一溶剂了。

溶解度很小时只能选择混悬转晶，或者用于反溶剂做溶析结晶。转晶时先考察常温，如果常温没有转晶，应该考虑升温（50~70℃）考察。或者加入少量良溶剂，提高溶解度，可以帮助转晶，这其实还是相当于单一溶剂。切记，只有一种晶型时没有转晶不代表该晶型就是稳定的，有时只是溶解度太小不能转而已。目前的96孔板筛选的二元溶剂蒸发结晶，在我看来，意义有限。混合溶剂里要重点关注水，因为水合物往往是需要重点考察的晶型。建议考察水和良溶剂不同比例的混悬转晶。

冷却结晶适合沸点比较高的溶剂（>70℃），加热溶清后骤冷至室温，析出固体后就收集分析。这样能得到亚稳晶型，如果太久，可能会转成稳定晶型，和蒸发结晶没有区别了。

视频1 氯化铵在溶液中的冷却结晶，像极了漫天飞舞的雪花。

悬浮转晶实验时，如果能得到无定型物作为起始物料，那是最好的。注意有些晶型之间的转晶需要很长时间，常温搅拌一个星期也转化不完并不罕见。

溶剂化合物和水合物脱溶剂后往往也能得到无水晶型，这也是必须要考察的。如果加热后分解或者形成无定型，可以不考察。

选择溶剂时尤其要注意溶液的稳定性，容易导致原料降解的溶剂显然是不能选的。不能在 XRD 上看到新的峰就认为发现新晶型了，也可能是杂质产生的。不同物质的 XRD 图谱一般不一样，晶型是相对同一种化合物而言的，得先确定原料没有变化。

结果分析、相转变和稳定性研究

● 1．PLM & XRD

得到固体后，应该先看看偏光显微镜，是不是晶体。在偏振光下，只有晶体才有双折射现象，是明亮的，其它都是黑的。晶体样品进一步做 XRD 分析，XRD 结果根据峰的位置和形状进行分类，峰的强度可以参考。如果某个 XRD 谱图能够用不同方法重复出来，尤其是不同的单一溶剂中，该谱图基本可以判断为一种晶型。根据 XRD 分类后的样品，挑选出一种峰形比较好的，用于后续分析。一种晶型的其它分析可以只做一次。

图3 某药物在偏光显微镜下的照片

XRD 谱图分析时注意，越靠前的衍射峰越重要，哪怕是很微弱的峰。后面的峰，尤其 30 以后的峰，可以忽略差异。结晶不好时，很多小的峰会消失或者合并。判断是不是一种晶型时，如果比标准谱图少峰，可以忽略，如果多峰，一定要谨慎，尤其是前面的峰。少峰可能是择优取向引起的，将样品研磨一下再测测，我碰到过比较极端的例子，研磨后峰的个数多了不止一倍。择优取向在针状或者片状晶体中才会比较明显。

XRD 分析一点要注意化合物在筛选过程中的降解。如果降解，杂质肯定会给出新的衍射峰，从而误判为一种新的晶型。可以做液相色谱分析纯度，也可以观察是否有颜色变化。另外一种简单方法就是，看看这种晶型是否能转成其它晶型。降解往往发生在特定溶剂中，如果其它溶剂不可能得到类似的晶型，而且转不回去，很可能是降解引起的。另外，红外在鉴定纯度上也是很有帮助的。

● 2．DSC，TGA & NMR

样品根据 XRD 谱图分类后，需要进一步判断是否无水晶型、水合物或者溶剂化合物。先看看 TGA 上是否有大的失重，失重是连续的还是台阶式的，通常台阶式的对应水合物或者溶剂化合物。再做 DSC 看看失重的地方是否有吸热峰，当然，峰的位置可能会有偏移。TGA 不能判断失重的是水还是溶剂，这个可以用 Q-NMR 来分析残留溶剂的种类和含量。最后我们根据失重的质量分数，计算溶剂或者水和化合物的摩尔比。整数的或者接近整数的很容易证明是溶剂化合物或者水合物。TGA 失重后，样品应该做 XRD 分析，看看是否有晶型变化。如果没有变化，脱去的往往是包裹的水或者溶剂。如果有变化，得到的新晶型往往是无水晶型。

有些人做到上面就结束实验了，其实上述所有证据大都是间接的，有时并不能充分证明样品是溶剂化合物或者水合物。失重有可能仅仅是溶剂残留高而已，DSC 上的吸热峰也可能仅仅是一种充分的证明方法是混悬转晶（打浆），如果存在甲醇的溶剂化合物，就让其它晶型在甲醇里打浆，必定会全部转成甲醇的溶剂化合物。如果溶解度太小，不能转，可以加少量良溶剂并适当升温，帮助转晶。水合物也是如此。

最后通过上述方法，可以将全部晶型按照无水晶型、水合物和溶剂化合物进行分类。水合物和溶剂化合物脱水或脱溶剂后也常常会得到无水晶型，这些无水晶型和结晶得到的无水晶型一样重要。

● 3．相转变研究

在判断出各种晶型后，需要研究晶型之间的稳定性和转化关系。先将无水晶型两种或者最好全部混合，然后进行混悬竞争实验，找到最稳定的无水晶型。需要考察不同溶剂，有时不同溶剂得到的稳定晶型是不一样的。如果溶剂的溶解度比较大，某种无水晶型的量特别少，可以先加入一种无水晶型，搅拌 30min 以上，至接近饱和后再加入另外一种晶型。不然量少的晶型如果全部溶解了，就没有意义了。

找到最稳定的无水晶型后，如果有水合物，我们还要考察水合物和无水晶型之间的稳定性。在某一溶解度中等的溶剂中，加入不同比例的水，加入水合物和无水晶型进行混悬竞争实验，看看最后的转化结果。

所有这些实验，做 XRD 分析就够了。

● 4．稳定性研究

稳定性研究包括吸湿性研究（DVS），机械稳定性（用研钵研磨几分钟）和稳定性考察（60℃或者40℃/75%RH，常常不做）。做完后需要测 XRD，检查是否有晶型变化。最后，根据稳定性结果和相对转化关系，推荐一种晶型用于后续研究。一般推荐无水晶型，水合物如果稳定性好，也可以推荐。对于某些制剂，可能只能选无水晶型（比如需要热熔挤出做制剂的）或者水合物（比如制剂中含水的）。

● 5．单晶和晶体标准图谱

晶型专利中，一般把 XRD 特征峰作为主要保护对象，大部分晶型专利都是这样写的。这种做法其实有个漏洞，单从 XRD 谱图有时难以定义一种晶型，因为可能在确定是单一晶型还是混合晶型上有困难，详情可以参考我的公众号文章《制剂中的晶型分析》。XRD 分析本身的误差有时比较大，美国药典规定，XRD 衍射峰的误差为 ±0.2° ，有时谱图的差异可能来源于测量误差。看过国内的一些晶型专利，利用含有几个不同衍射峰，而大部分衍射峰都一样的谱图，去申请专利，也有获得授权的，不过现在很难了。只有 XRD 谱图的晶型专利，容易被钻漏洞，做出带有几个不同 XRD 特征峰的样品往往并不难。

确定单一晶型最好的办法是培养出该晶型的单晶，解出晶体结构。通过单晶数据可以拟合得到 XRD 标准谱图，这样就可以很明确很严格地定义一种晶型了，不用老是纠结多出来的某个峰是不是新晶型产生。国外的晶型专利，常常在专利正文中列出该晶型的单晶数据，包括晶胞参数和原子坐标。有些即使没有培养出单晶，也通过粉末衍射数据拟合出单晶结构，这样有利于晶型保护。需要注意，权利要求书里仍然只有 XRD 特征峰，不需要加入晶体结构数据。单晶模拟得到的 XRD 标准谱图，有时和实验测得的 XRD 会有少量峰有区别。

小结

晶型筛选也是大批量的小规模结晶研究，制定筛选方案前需要知道哪些因素会影响到晶型，尽可能覆盖常见的影响因素。大规模筛选实验后根据 XRD 图谱对样品进行分类，找出可能存在的多晶型，并用小试实验加以重复，制备样品用于进一步分析。根据 TGA、DSC 等结果将晶型分类（溶剂合物、水合物和无水晶型），判断晶型之间的稳定性和相互转化关系，最后推荐一种合适晶型用于下游开发。本篇是新药开发阶段晶型研究的主要策略和流程，下篇将分享仿制药的晶型研究开发策略和建议，敬请持续关注。

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